利用VideometerLab 4多光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行藜麥霜霉病研究

介紹

藜麥(Chenopodium quinoa)是一種作物，營(yíng)養(yǎng)豐富，在多個(gè)國(guó)家廣有種植。真菌病如霜霉病限制了谷物產(chǎn)量，培育抗性品系，如抗霜霉病品系是藜麥育種的中心目標(biāo)。

利用常規(guī)RGB成像來(lái)測(cè)量藜麥對(duì)霜霉病的表型反應(yīng)(Peronospora variabilis ) 測(cè)量比較困難，原因在于來(lái)自不同藜麥基因型在葉片上有不同綠色和紅色斑點(diǎn)進(jìn)行干擾，參見(jiàn)圖1和圖2。 

1.目標(biāo)

開(kāi)發(fā)圖像分析規(guī)程來(lái)區(qū)分健康藜麥葉片組織以及感染霜霉病的藜麥葉片組織。研究利用Videometer多光譜成像系統(tǒng)對(duì)嚴(yán)重度程度表型和孢子形成進(jìn)行研究。

嚴(yán)重程度是葉片正面損傷的面積占整個(gè)葉片面積的百分比。依基因型不同，顏色可為桔色、黃色或紅色。

孢子形成是損傷部上方孢子量，以百分比測(cè)量，通過(guò)測(cè)量葉片正面進(jìn)行評(píng)估。 

圖1 葉片正面嚴(yán)重度癥狀

圖2 葉片正面孢子形成

2.多光譜圖像分析

研究人員利用VideometerLab 4多光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行多光譜成像，積分球確保對(duì)樣品的均一照明(圖3)。每個(gè)獲取的圖像層由19個(gè)不同圖像波段組成，波長(zhǎng)涵蓋365nm（UVA）到970nm（NIR）。圖像的每個(gè)像素分辨率為~41 µm。每個(gè)圖像層的分辨率為2192X2192像素。

圖像分析嚴(yán)重度模型

從G9基因型葉片正面(圖4)清楚看到了黃化現(xiàn)象(A)，拍攝了RGB圖像（常規(guī)相機(jī)，人眼可見(jiàn)光波段。(B)和(C)顯示了多光譜圖層中的2個(gè)波段，藍(lán)光490nm(B)和黃光570nm(C)。對(duì)健康植物組織和黃化界定進(jìn)行了初始標(biāo)記，轉(zhuǎn)換建立了模型(D)，通過(guò)nCDA（歸一化典型判別分析將19個(gè)波段信息（圖像中多個(gè)圖層），轉(zhuǎn)換為了整個(gè)圖層的代表像素范圍值。之后切割(E和F)，可用于所有圖像-所有品系和基因型，獲取有黃化組織（E黃色）百分比定量分析，該特定葉片比例為68.0%，或者包括紅色覆蓋孢子區(qū)(F)，比例為18,9%，黃化（黃色）比例68%，孢子和黃化區(qū)綜合面積占比75.8%。 

圖像分析孢子形成

在葉片正面（底部），RGB圖像中的G9基因型清晰可見(jiàn)到孢子形成圖像（下底部A和B放大）。盡管在可見(jiàn)光波段很難檢測(cè)到單個(gè)波段，這里特別標(biāo)出了藍(lán)光波段（490nm）（C）。進(jìn)入NIR（780nm）波段（下左部的D和E放大），清晰看見(jiàn)了孢子。使用該信息（僅標(biāo)識(shí)黑灰色孢子）可幫助我們區(qū)分切割孢子像素（F），并將該面積定量，該葉片孢子比例為12.5% （黃色顯示），不包括黃化部分面積。

另外，此處的孢子標(biāo)識(shí)與正面圖像分析而言更加保守。 覆蓋的非黑灰區(qū)的像素部分 (像素比單個(gè)孢子要大）估計(jì)，孢子比例為~23%（此處未予以顯示)。

圖4(A) sRGB圖像。(B)，490nm(藍(lán)光)，(C)，570nm(黃色)，(D) 轉(zhuǎn)換，(E)和(F)，2種類型定量分割。

圖5(A) sRGB 圖像，(B)490nm(藍(lán)光)，(C) 570nm(黃色)，(D)轉(zhuǎn)換，(E)定量分割。

結(jié)果

圖6:133個(gè)基因型的平均嚴(yán)重程度（%）分布

表1手工以及基于多光譜表型成像的藜麥霜霉病互作

研究對(duì)相關(guān)的132個(gè)藜麥基因型對(duì)霜霉病的表型反應(yīng)進(jìn)行了研究。設(shè)置了3個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)有4個(gè)區(qū)塊，配有復(fù)制控制樣品以及非復(fù)制基因型樣品。找到了對(duì)P. variablilis 反應(yīng)變異大的藜麥基因型，發(fā)現(xiàn)了基因型對(duì)互作有著顯著影響 (p-value = 1.18 x 10-18) 圖6。研究人員對(duì)圖像表型研究結(jié)果進(jìn)行了比較，研究人員正在開(kāi)發(fā)適合覆蓋整個(gè)反應(yīng)的算法。該綜述中，研究者展示了與G9基因型相對(duì)應(yīng)的葉片圖像。結(jié)果總結(jié)在表1中，來(lái)不同區(qū)塊和試驗(yàn)的分屬不同植株的10片葉子取了平均值。

結(jié)論

多光譜成像如嚴(yán)格按照規(guī)程使用、記錄完善的話，是非常強(qiáng)勁的表型工具。對(duì)圖像定量基于算法應(yīng)用，這需融合對(duì)疾病反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)。對(duì)孢子形成，菌絲萌發(fā)，滲透，侵染面積以及健康組織識(shí)別可提供更加近似的像素標(biāo)識(shí)。

目前研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了可應(yīng)用于藜麥霜霉病互作的應(yīng)用于損傷組織算法。